Affinitätsmarkierungen sind eine Klasse von Enzyminhibitoren, die kovalent an ihr Ziel binden und dessen Inaktivierung bewirken. Das Markenzeichen einer Affinitätsmarkierung ist die Verwendung einer Zielgruppe, um spezifisch und reversibel eine schwach reaktive Gruppe an das Enzym abzugeben, die irreversibel an einen Aminosäurerest bindet. Der Targeting-Teil des Markers ähnelt oft dem natürlichen Substrat des Enzyms, so dass vor der kovalenten Bindung ein ähnlicher Modus der nichtkovalenten Bindung verwendet wird. [1][2] Ihre Brauchbarkeit in der Medizin kann durch die Spezifität des ersten nichtkovalenten Bindungsschrittes eingeschränkt sein, während die wahlfreie Wirkung jedoch keine Rolle spielt können für Zwecke wie Affinitätsmarkierung verwendet werden - eine Technik zur Validierung der substratspezifischen Bindung von Verbindungen. [1]
Diese Markierungen sind nicht auf Enzyme beschränkt, sondern können auch mit Antikörpern oder Ribozymen reagieren obwohl diese Verwendung weniger verbreitet ist. Obwohl Proteine wie Hämoglobin kein aktives Zentrum haben, können Bindungstaschen aufgrund ihrer Affinität ausgenutzt und somit markiert werden.
Klassifizierungen [ edit ]
Affinitätsetiketten lassen sich aufgrund ihrer reaktiven Gruppen und ihrer Versandart in drei verschiedene Kategorien einteilen. [3]
Klassische Affinitätsetiketten edit ]
Diese Kategorie umfasst den einfachsten Ansatz, ein Elektrophil mit geringer intrinsischer Reaktivität an eine nichtkovalente Bindungskomponente zu koppeln, die häufig das natürliche Substrat imitiert. Der Schlüssel zu dieser Bezeichnung ist, dass die Reaktivität des Elektrophils nicht durch das Enzym verändert wird und dass die nichtkovalente Bindungskomponente dazu dient, die Anwesenheit und Lebensdauer des Elektrophils im aktiven Zentrum zu erhöhen (effektive Molarität). Die schwach reaktive Gruppe kann mit funktionellen Gruppen außerhalb des aktiven Zentrums oder mit anderen Proteinen reagieren, aber die Selektivität wird durch die nichtkovalente Bindungskomponente verliehen. Kinetische Signaturen dieses Inhibitortyps können in der Sättigung gefunden werden, da die kovalente Reaktion (kinact) bei hohen Inhibitorkonzentrationen zum geschwindigkeitsbestimmenden Schritt wird. Eine Handvoll von Medikamenten wie Afatinib hat die FDA-Zulassung durch diesen Ansatz erhalten. Der inverse Ansatz der Verwendung eines schwach nucleophilen Inhibitors zum Angriff auf ein Protein-gebundenes Elektrophil wurde ebenfalls untersucht. Dieser Ansatz hat aufgrund des Fehlens von Proteinelektrophilen viel weniger Beachtung gefunden, und nur solche mit geeigneten Cofaktoren können angegriffen werden. [1][3]
Quiescent-Affinitätslabel [ edit
vielversprechender Ansatz zur Hemmung von Enzymen mit "maskierten" reaktiven Funktionalitäten, die nur innerhalb des aktiven Zentrums sichtbar werden. Dieser Ansatz unterscheidet sich von auf Mechanismen basierenden Inaktivatoren darin, dass die Katalyse "off-pathway" sein muss. Eines der besten Beispiele zur Erklärung dieser Form der Katalyse ist die Inaktivierung von Dimethylargin-Dimethylaminohydrolase (DDAH) durch 4-Halogenpyridine. Bei einem physiologischen pH-Wert weist die 4-Halogen-Gruppe eine nahezu vernachlässigbare Reaktivität mit Thiolaten auf, aber bei Protonierung des Stickstoffs steigt die Reaktivität um das 4500-Fache. Diese Protonierung erfolgt durch einen Aspartatrest, der normalerweise nicht an der Katalyse beteiligt ist. Nach dem Angriff des aktiven Zentrums Cystein und dem Verlust des Halogenids wird das Enzym irreversibel modifiziert. Dieses Erfordernis der Katalyse stellt die Selektivität der Modifikation ein. [3] Diese Klasse ist nicht auf Halogenpyridine beschränkt, und funktionelle Gruppen, einschließlich Epoxide und Peptidylacyloxymethylketone, wurden verwendet. Die kinetische Signatur dieser Klasse ähnelt der von klassischen Affinitätsmarkierungen. Dieser Begriff wurde früher verwendet, um Affinitätsmarkierungen zu beschreiben, die schwach reaktive Gruppen enthalten, aber die neuere Literatur hat sich mit der Notwendigkeit einer Off-Pathway-Katalyse beschäftigt. [4]
Photoaffinitätsmarkierungen edit ]
Photoaffinitätslabel sind durch nichtenzymatische Reaktivität gekennzeichnet, die durch Lichteinwirkung erzeugt wird, und eine nichtkovalente Zielgruppe, um die effektive Molarität dieser reaktiven Gruppe im aktiven Zentrum zu erhöhen. Während diese Technik theoretisch klingt, wird häufig ein niedriger Markierungsgrad beobachtet, hauptsächlich aufgrund des Abschreckens der reaktiven Spezies durch Lösungsmittel oder andere Spezies in Lösung. Dieses Abschrecken kann jedoch vorteilhaft sein, da es ein so schneller Prozess ist, dass die reaktive Spezies, sobald sie gebildet ist, nicht in nennenswertem Maße diffundiert und nur mit Molekülen reagiert, an die sie unmittelbar angrenzt.
Photoaffinitätslabels sind nicht sehr vielversprechend für die Hemmung oder den Einsatz von Medikamenten, eignen sich jedoch zur Identifizierung von Ligandenbindungsstellen. Reaktive Gruppen wie Nitrene oder 2-Aryl-5-carboxytetrazole werden häufig eingesetzt, um hochreaktive, nichtselektive Carbene bzw. mäßig selektive Nitrilimin-Intermediate zu erzeugen. [2][3]
Verwendung der Affinitätsmarkierung edit ]]
Bei der Charakterisierung eines Enzyms müssen die für die Katalyse verantwortlichen Aminosäurereste identifiziert werden. Während klar ist, dass die Röntgenkristallographie detailliertere 3-D-Informationen über das aktive Zentrum liefert, wird nur ein statisches Bild zurückgegeben, und Schwierigkeiten können bei der Co-Kristallisation des Substrats oder der Mimik aufgrund des enzymatischen Umsatzes auftreten.
Das klassische Beispiel für die Verwendung von Affinitätsetiketten für diesen Zweck ist die Kartographie der aktiven Chymotrypsinstelle. Durch die Verwendung von drei verschiedenen Affinitätsmarkierungen, die reaktive Gruppen (Halogenmethylketone oder Phosphofluoride) auf verschiedenen Regionen des natürlichen Substratkerns plazierten, konnten die relativen Positionen und die Identität von drei verschiedenen Aminosäuren bestimmt werden. [1] Ein anderes bemerkenswertes Beispiel für die Verwendung von Affinität Markierung zur Bestimmung des aktiven Zentrums eines Enzyms ist die von Grachev et al. was zur Charakterisierung der β-Untereinheit der Kern-RNA-Polymerase als der für die Phosphodiester-Bindungsbildung im Prozess der prokaryontischen Transkription verantwortlichen Untereinheit führte. [5]
Aktivitätsbasiertes Protein-Profiling (ABPP) [ edit ]
Die Basiseinheit der auf Aktivität basierenden Proteomik ist die Sonde, die typischerweise aus zwei Elementen besteht: einer reaktiven Gruppe (RG, manchmal als "Sprengkopf" bezeichnet) und einem Tag. Zusätzlich können einige Sonden eine Bindungsgruppe enthalten, die die Selektivität erhöht. Die reaktive Gruppe enthält normalerweise ein speziell entworfenes Elektrophil, das kovalent an einen nukleophilen Rest im aktiven Zentrum eines aktiven Enzyms gebunden wird. Ein Enzym, das inhibiert oder posttranslational modifiziert wird, reagiert nicht mit einer Sonde auf Aktivitätsbasis. Das Tag kann entweder ein Reporter wie ein Fluorophor oder eine Affinitätsmarkierung wie Biotin oder ein Alkin oder Azid zur Verwendung mit der 1,3-dipolaren Huisgen-Cycloaddition (auch als Click-Chemie bekannt) sein.
Siehe auch [ edit ]
Referenzen [ edit
- ^ a b c d d D. Wofsy L., Metzger H., Singer SJ (November 1962). "Affinitätsmarkierung - ein allgemeines Verfahren zum Markieren der aktiven Zentren von Antikörper- und Enzymmolekülen". Biochemistry . 1 : 1031–9. doi: 10.1021 / bi00912a013. PMID 14001461.
- ^ a b Colman RF (1995). "Affinitätsmarkierung und verwandte Ansätze zum Targeting spezifischer Enzymstandorte". In Biswas BB, Roy S. Proteins: Structure, Function and Engineering . Subzelluläre Biochemie. 24 . Boston, MA: Springer. S. 177–205. doi: 10.1007 / 978-1-4899-1727-0_7. ISBN 978-1-4899-1729-4.
- ^ a b c c d Tuley A, Fast W (Juni 2018). "Die Taxonomie kovalenter Inhibitoren". Biochemistry . 57 (24): 3326–3337. doi: 10,1021 / acs.biochem.8b00315. PMC 6016374 . PMID 29689165.
- ^ Johnson CM, TW Linsky, DW DW Yoon, Person MD, Fast W (Februar 2011). "Entdeckung von Halopyridinen als ruhende Affinitätsmarkierungen: Inaktivierung von Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase". Zeitschrift der American Chemical Society . 133 (5): 1553–62. doi: 10.1021 / ja109207m. PMC 3038607 . PMID 21222447.
- Grachev, M.A., T.I. Kolocheva, E.A. Lukhtanov und A.A.
Mustaev 1987. Untersuchungen zur funktionellen Topographie der Escherichia coli RNA-Polymerase. Hochselektive Affinitätsmarkierung durch
Analoga von initiierenden Substraten. EUR. J. Biochem. 163: 113-121. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1987.tb10743.x
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