Southwestern Blotting basierend auf Southern Blotting (das von Edwin Southern erstellt wurde) und erstmals von B. Bowen, J. Steinberg und Mitarbeitern im Jahr 1980 beschrieben wurde [1] ist eine Labortechnik, bei der Identifikation durchgeführt wird und Charakterisierung von DNA-Bindungsproteinen (Proteine, die an DNA binden) [2] durch ihre Fähigkeit, an spezifische Oligonukleotidsonden zu binden. Die Proteine werden durch Gelelektrophorese getrennt und anschließend auf Nitrocellulosemembranen übertragen, ähnlich wie bei anderen Blotting-Typen.
Der Name südwestlicher Blotting basiert auf der Tatsache, dass diese Technik DNA-Bindungsproteine nachweist, da der DNA-Nachweis durch Southern-Blotting und der Protein-Nachweis durch Western-Blotting erfolgt.
Seit dem ersten Bluten im Südwesten wurden jedoch viele weitere vorgeschlagen und entdeckt. Die früheren Protokolle wurden durch die Notwendigkeit großer Proteinmengen und deren Anfälligkeit für den Abbau während der Isolierung behindert.
"Southwestern Blot-Mapping" wird zur schnellen Charakterisierung von DNA-Bindungsproteinen und ihrer spezifischen Stellen in der genomischen DNA durchgeführt. Proteine werden auf einem Polyacrylamidgel (PAGE), das Natriumdodecylsulfat (SDS) enthält, getrennt, durch Entfernen von SDS in Gegenwart von Harnstoff renaturiert und durch Diffusion auf Nitrozellulose geblottet. Die interessierende genomische DNA-Region wird durch Restriktionsenzyme gespalten, die ausgewählt sind, um Fragmente geeigneter, aber unterschiedlicher Größe zu erzeugen, die anschließend endmarkiert werden und an die getrennten Proteine binden können. Die spezifisch gebundene DNA wird von jedem einzelnen Protein-DNA-Komplex eluiert und durch Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Es wurde nachgewiesen, dass gewebespezifische DNA-Bindungsproteine durch diese Technik nachgewiesen werden können. Darüber hinaus ermöglicht ihre sequenzspezifische Bindung die Reinigung der entsprechenden selektiv gebundenen DNA-Fragmente und kann die proteinvermittelte Klonierung von DNA-Regulationssequenzen verbessern.
Referenzen [ edit ]
No comments:
Post a Comment